Caspase-3活性檢測試劑盒 (比色法)

Caspase全稱為含半Cystine的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)。Caspase 是一類蛋白酶家族，成員較多，該家族已顯示在凋亡中起關(guān)鍵作用。哺乳動物caspases 可分為三個功能組：啟動子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9 和 10），執(zhí)行者半胱天冬酶（Caspase-3、6 和 7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-3、4、5、11 和 12）。Caspase-3（也稱為Yama，CPP32 和 Apopain）在天冬氨酸殘基的羧基末端切割其底物?；钚?Caspase-3由兩組同源二聚體（17 和 12 kDa） 組成，它們均來自兩個前體 Caspase -3 多肽，并具有兩個活性位點(diǎn)。Caspase-3 與 Caspases-8 和 9一起位于細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵連接點(diǎn)。本試劑盒基于Caspase-3 水解肽底物Ac-DEVD-pNA（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-對硝基苯胺），產(chǎn)生黃色的對硝基苯胺（pNA），pNA 在405nm 附近有強(qiáng)吸收,從而可以通過測定吸光度來檢測 Caspase-3的活性。

注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。

細(xì)胞裂解液: 使用前按1mL細(xì)胞裂解液加入10 µL DTT的比例加入DTT，置于冰上備用。

1×反應(yīng)緩沖液 (含 DTT): 使用前將反應(yīng)緩沖液（2×）加等體積去離子水稀釋到反應(yīng)緩沖液 (1×)，再按1mL反應(yīng)緩沖液 (1×)加入10µL DTT的比例加入DTT，置于冰上備用。

底物: 即用型；實驗過程中置于冰上；–20℃保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。

DTT : 即用型；實驗過程中置于冰上；–20℃保存。用不完的試劑-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融。

標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：取20µL pNA標(biāo)準(zhǔn)品 (10mM)用180µL 1×反應(yīng)緩沖液(含 DTT)稀釋至1000µM pNA標(biāo)準(zhǔn)品。用1000µM pNA按下表所示，進(jìn)行下一步稀釋：

注意：每次實驗，請使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品。用不完的標(biāo)準(zhǔn)品-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融

1. 通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，建議對每個樣本設(shè)置不誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，Trypsin消化收集細(xì)胞。600g，4℃離心5min，小心吸去上清液。用1mL PBS洗滌細(xì)胞2次。離心后，去除上清液。在1mL細(xì)胞裂解液中重懸 5×106個細(xì)胞。

對于懸浮細(xì)胞，600g，4℃離心5min，小心吸去上清液。用1mL PBS 洗滌細(xì)胞2次。離心后，去除上清液。在1mL細(xì)胞裂解液中重懸 5×106個細(xì)胞。

對于組織，將0.1g組織切成小塊，用PBS清洗組織，加入1mL細(xì)胞裂解液，冰浴勻漿。

2. 裂解物冰上孵育 15-20min。

3. 16,000g，4℃離心15min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中，置冰上待測。

4. 立即測定 Caspase-3 的酶活性或-80℃保存樣品。同時可以取少量樣品用 Bradford 法測定蛋白濃度。

注意：1. 推薦使用新鮮樣品。如果不立即進(jìn)行實驗，樣本可在-80℃保存一個月，使用前，在冰上解凍。

2. 在樣品制備步驟中請勿使用蛋白酶抑制劑，可能會干擾測定。

3. 如需測定蛋白濃度，推薦使用Bradford 法蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到405nm。

2. 操作表（下述操作在96孔板中操作）：

3. 混勻，37℃孵育1-2h，檢測405nm處吸光值。空白孔記為A空，標(biāo)準(zhǔn)孔記為A標(biāo)、測定孔記為A測。計算 ΔA測=A測-A空，ΔA標(biāo)=A標(biāo)-A空。

注意：1.空白孔只需測定1次。實驗之前建議選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗；如果ΔA測小于0.001可適當(dāng)加大樣本量，如果ΔA測大于1.0，用細(xì)胞裂解液適當(dāng)稀釋樣品后再進(jìn)行測定，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

2.在反應(yīng)體系中，適當(dāng)混勻，注意避免在混勻時產(chǎn)生氣泡；3.發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定405nm 的波長。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長孵育時間，甚至可以孵育過夜。

結(jié)果計算：

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以ΔA 標(biāo)為x軸，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計算結(jié)果）。將樣本的 ΔA測帶入方程得到y(tǒng)值（μM即nmol/mL）。

2. Caspase-3 活性的計算

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，37℃環(huán)境下，每毫克蛋白在反應(yīng)體系中每小時剪切1nmol pNA 底物產(chǎn)生1nmol游離pNA 的酶量定義為1個酶活力單位。

Caspase-3 活性（U/mg prot）=y×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=2.1×y÷Cpr÷T

（2）按樣本鮮重計算

活性單位定義：為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，37℃環(huán)境下，每克樣本在反應(yīng)體系中每小時剪切1nmol pNA 底物產(chǎn)生1nmol游離pNA 的酶量定義為1個酶活力單位。

Caspase-3 活性（U/g 鮮重)=y×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2.1×y÷W÷T

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，37℃環(huán)境下，每104個細(xì)胞在反應(yīng)體系中每小時剪切1nmol pNA 底物產(chǎn)生1nmol游離pNA 的酶量定義為1個酶活力單位。

Caspase-3 活性（U/104 cell)=y×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=2.1×y÷細(xì)胞數(shù)量÷T

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.105mL；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時間，h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品鮮重，g；V樣總：加入提取液的體積，1mL；細(xì)胞數(shù)量：以萬為單位的細(xì)胞數(shù)量。